可视化膜芯片检测转基因大豆研究 本文关键词：转基因，可视化，大豆，芯片，检测
可视化膜芯片检测转基因大豆研究 本文简介：摘要:目的研究可视化膜芯片技术对转基因大豆及其制品的检测能力,验证该技术的灵敏度及可行性。方法利用可视化膜芯片对转基因大豆及其制品进行检测,并采用行业标准要求的实时荧光PCR方法进行对比验证。结果该技术具备典型外源基因片段的判定能力,能够用于大豆及其制品中转基因成分的检测,方法检出限为0.1%,比对
可视化膜芯片检测转基因大豆研究 本文内容：
摘要:目的研究可视化膜芯片技术对转基因大豆及其制品的检测能力,验证该技术的灵敏度及可行性。方法利用可视化膜芯片对转基因大豆及其制品进行检测,并采用行业标准要求的实时荧光PCR方法进行对比验证。结果该技术具备典型外源基因片段的判定能力,能够用于大豆及其制品中转基因成分的检测,方法检出限为0.1%,比对验证实际样品的检测结果与行业标准荧光PCR法一致。结论该技术便捷、直观、准确,可用于大豆及其制品的转基因成分快速初筛与鉴定。
关键词:转基因大豆;可视化;膜芯片;检测
1引言
转基因技术是人类获取食物方式的伟大变革,但其安全性也是食品生产与消费领域的敏感问题[1],在科学界尚无明确定论的背景下,为了维护消费者的知情权和选择权,许多国家相继颁布了转基因相关产品的标识制度,我国相关法律法规就要求对食品原料是否包含转基因成分进行明确标识[2],这就需要建立准确、便捷的转基因检测方法来满足监管需求。目前针对转基因作物的检测技术主要分为2类:一类为基于蛋白质水平上的检测技术,例如酶联免疫吸附法、免疫印迹法和蛋白质芯片法等;另一类为基于核酸水平上的检测方法,常见的有聚合酶链式反应法、核酸分子杂交法及环介导等温扩增法等[3]。由于DNA在各种生物样本中容易获得,且稳定性高,因此基于核酸水平的检测方法更具优势和实用性,可视反向点杂交膜芯片技术即是核酸检测方法的衍生技术应用。该方法基于多重PCR技术,对待测物中基因靶标进行扩增,检测采用的膜芯片是将人工合成的碱基序列作为探针固定在硝酸纤维素膜或尼龙膜等固相载体膜上,在液体环境中如果PCR产物中含有与探针碱基互补的序列,杂交时特定序列会被探针特异结合,通过酶-底物显色,从而产生肉眼可辨的信号[4]。膜芯片技术将杂交、清洗、酶孵育和显色等重要环节集成化,实现核酸的精准、直观与自动化检测。本研究利用该技术对市场上常见大豆及其制品进行转基因成分检测,并采用行业标准方法予以验证,为转基因制品的实用检测提供参考。
2材料与方法
2.1材料与试剂
植物基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);转基因大豆膜芯片检测试剂盒(四川华汉三创生物科技有限公司);转基因大豆标准品GTS40-3-2与非转基因大豆克山1号(广州迪澳生物科技有限公司);豆奶粉(甘肃鸿泰食品有限公司);豆浆(兰炼三叶食品有限公司);PCR引物及探针[生工生物工程(上海)股份有限公司];其余化学试剂为市售分析纯试剂。
2.2仪器与设备
MFS-8膜芯片杂交仪(四川华汉三创生物科技有限公司);S1000ThermalCycler梯度PCR仪(美国Bio-rad生物科技有限公司);ViiA7荧光定量PCR仪(美国AppliedBiosystems有限公司);SorvallST16R高速冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计(美国ThermoFisherScientific有限公司);SPEX6875D液氮冷冻研磨仪(美国SPEXSamplePrep有限公司);RVC2-25CDplus真空浓缩仪(德国CHRIST有限公司)。
2.3方法
2.3.1DNA提取及浓度测定取各类大豆样品10g左右,置于冷冻研磨仪中,液氮环境下研磨10min至细粉状,液氮自然挥干,豆浆和豆奶粉不作前处理。取以上各固体样品5mg,液体样品500μL转移至预先装有20μLRNaseA(10mg/mL)和5μLβ-巯基乙醇的1.5mL离心管中,之后提取步骤参照植物基因组DNA提取试剂盒说明书,最终得洗脱液约50μL于-20℃保存[5]。DNA浓度和纯度测定:使用超微量分光光度计对提取的DNA样本纯度及浓度进行测定。结果显示A260nm/A280nm均大于1.8且小于2.0,表明样品DNA纯度较高,见图1。核酸浓度检测见图2,根据DNA质量浓度的计算方法,当A260nm=1时,双链DNA浓度为50μg/mL[6],本次实验提取DNA浓度均大于14.5μg/mL。大豆基因组(单倍体)大小n=1.1×109bp(单位:碱基对),碱基对质量q=1.096×10−21g/bp,大豆基因组(单倍体)质量m(q×n)=1.21×10−12g/拷贝[7],计算得实验提取原始DNA每μL含量均大于1.2×104个拷贝,可满足后续检验需要。2.3.2基因扩增利用多重PCR(multiplexPCR)以基因组DNA为模板进行基因扩增,并设置检测试剂盒配置的转基因大豆基因组DNA作为阳性质控,纯净水为空白对照,对后续PCR扩增体系和膜芯片杂交反应进行质量控制[8]。反应体系:取样品及质控DNA各5μL,2×MultiplexPCRMasterMix10μL,Nuclease-FreeWater5μL。PCR扩增程序:37℃保温10min,95℃预变性10min,然后95℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸15s,35个循环,最后72℃延伸5min,降至室温。2.3.3膜芯片杂交使用膜芯片杂交仪可自动依次完成去活化、杂交、清洗、酶孵育、显色等步骤。去活化目的是将没有固定上探针的活性基团封闭,增强特异性;杂交的目的是通过已固定于膜芯片上的探针将待测PCR产物中对应基因片段捕获;酶孵育是杂交的关键步骤,PCR产物带有生物素标记,膜芯片使用碱性磷酸酶作为亲和素,如果PCR产物含有目的基因片段,通过生物素与亲和素的作用可将碱性磷酸酶连接到膜上;显色的目的是通过酶与对应底物发生变色反应,来指示膜上是否有碱性磷酸酶,从而间接表明PCR产物中是否含有目的基因片段[9]。图3为膜芯片检测结果,灰色圆点表示该位点阳性,无圆点表示该位点阴性,由检测结果可知,转基因大豆GTS40-3-2检出CaMV35S启动子、NOS终止子和EPSPS目的基因,阳性质控检出FMV35S启动子、CaMV35S终止子和Pat目的基因,大豆克山1号、豆奶粉和豆浆均未检出转基因特征片段。各膜芯片的阳性和大豆凝集素Lectin点位均显色,阴性均不显色,表明检测正常有效。2.3.4方法灵敏度将转基因大豆GTS40-3-2和非转基因大豆克山1号分别用液氮冷冻研磨仪制粉,以克山1号大豆粉为本底,将GTS40-3-2大豆粉混入样品并逐级稀释,设计浓度比例分别为10%、1%、0.1%及0.01%(w:w),每个浓度制备3个平行样,按2.3.1、2.3.2和2.3.3方法提取DNA、基因扩增和膜芯片杂交,结果见表1。该检测方法对于0.1%含量以上的非转基因大豆掺入具有检出能力,0.01%浓度不具备检出能力。对比现有农作物转基因检测技术,侧流免疫测定法(immunoassayoflateralflux,ILF)可有效检测大豆种子中1.0%的转基因大豆[10],芯片式数字PCR可定量检测1%的转基因大豆材料[11],微滴式数字PCR结合毛细管凝胶电泳可分辨0.05%含量的外源DNA混合物,实际农作物中0.1%转基因作物的检测限[12],等温多自配核酸扩增(isothermalmultipleself-matching-initiatedamplification,IMSA)技术检测限也为0.1%[13],实时荧光PCR方法可监测0.02g/100g样本中的转基因DNA[14],新兴的石墨烯量子点(nanometregraphenequantumdots,NGQDS)DNA杂交技术,可实现含转基因大豆0.5%的真实样品鉴定[15]。可见膜芯片在检测灵敏度指标上与核酸类方法基本相当,优于免疫蛋白技术,也优于其他非主流检测技术[16]。
3方法验证
采用行业标准[17]荧光定量PCR法对转基因大豆GTS40-3-2、阳性质控、非转基因大豆克山1号、豆奶粉样品和豆浆样品进行方法验证。
3.1引物和探针
针对转基因大豆GTS40-3-2典型外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4-EPSPS目的基因和大豆内源基因Lectin,采用SN/T1202-2010行业标准提供的序列,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物及探针见表2。
3.2FQ-PCR反应体系及条件
反应体系:将各样品DNA调整至50ng/μL,取5μLDNA至于20μL反应管,加2×TaqManPCRMasterMix12.5μL,上下游引物(10μmol/L)各1μL,探针(10μmol/L)0.5μL,超纯水补至20μL。扩增程序:37℃保温5min,95℃预变性10min,然后95℃变性15s,60℃退火60s,72℃延伸15s,40个循环,最后72℃延伸5min。
3.3结果与分析
FQ-PCR扩增结果表明,大豆GTS40-3-2的CaMV35S、NOS和CP4-EPSPS等3种外源特征基因都得到有效扩增,而非转基因大豆克山1号、豆奶粉样品和豆浆样品只有大豆内源基因Lectin得到扩增,FQ-PCR扩增曲线如图4。FQ-PCR检测结果与膜芯片一致,膜芯片方法可用于转基因大豆的检测。事实上2种方法基于相同的核酸扩增技术,但膜芯片系统预设了转基因探针,使其不但保持了核酸扩增精准技术特性,且省略了PCR技术逐一制备引物等步骤,实现了检测效率提升。
4结论与讨论
本研究利用可视化膜芯片技术对大豆及大豆制品进行了成分检测,实验中除转基因大豆标准品外,其他均未检出外源基因片段,该结果同时采用行业标准[17]方法进行了确认。结果表明,可视化膜芯片技术能够检测出大豆转基因成分,方法检出限达0.1%,由于更低的转基因成分含量已失去商业利益需求,因此完全满足实际工作需要。该技术不需要设计引物和探针,又兼顾生物分子技术精准特性,便捷、直观、准确,可用于大豆及其制品的转基因成分快速初筛与鉴定。当然,我们也应该认识到膜芯片技术的局限性,目前,根据美国和欧盟公布的信息统计,世界范围内已批准商业化种植的转基因大豆品系已超过16种[18],至2017年我国批准进口的转基因大豆有8种品系[19],主要是美国孟山都公司研制的GTS40-3-2品系和MON89788品系,德国拜耳公司研制的A2704-12品系,而仅这3种品系所包含的外源基因片段就超过10种[20],因此为满足更精准的实际检测需要,膜芯片必须固定更多的特异性探针,成为该技术进一步探索的方向。
作者：祖新 徐轶飞 李羽翡 段鹏 范鹏飞 杨陶丽薇 单位：甘肃省食品检验研究院
可视化膜芯片检测转基因大豆研究 来源：网络整理
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