华蒲公英的特性及其组织培养技术 本文关键词：蒲公英，特性，培养，组织，技术
华蒲公英的特性及其组织培养技术 本文简介：摘要：华蒲公英具有较强的环境适应能力，是植物抗逆性研究的优良材料。通过多因素分析种子最佳消毒时间，萌发、增殖和生根培养基的最适激素浓度。结果显示，最佳消毒方案为75%乙醇消毒30s+无菌水冲洗2次+0.1%升汞消毒10min+无菌水冲洗5次，最佳萌发培养基的激素选择是6-BA0.2mg/L、GA31
华蒲公英的特性及其组织培养技术 本文内容：
摘 要： 华蒲公英具有较强的环境适应能力，是植物抗逆性研究的优良材料。通过多因素分析种子最佳消毒时间，萌发、增殖和生根培养基的最适激素浓度。结果显示，最佳消毒方案为75%乙醇消毒30 s+无菌水冲洗2次+0. 1%升汞消毒10 min+无菌水冲洗5次，最佳萌发培养基的激素选择是6-BA 0. 2 mg/L、GA3 1. 0 mg/L,最佳增殖培养基的激素选择为NAA 0. 1 mg/L、6-BA 0. 5 mg/L,最佳生根培养基的激素选择是NAA 1. 0 mg/L.通过实验研究，筛选华蒲公英组培不同阶段的培养基配方，建立华蒲公英组培体系。
关键词： 华蒲公英； 多糖含量； 增殖率； 干物率；
Abstract: Taraxacum borealisinense Kitam. isa perennial herb with the same source of medicine and food,belonging to Taraxacum, Compositae. In this study, we used Taraxacum borealisinense seeds as experimental materials and established the tissue culture system by optimizing culture conditions in each stage. The results showed that the optimumdisinfection method was that the material was disinfected with75 % ethanol for 30 s and rinsed with sterile water for twice,and then disinfected with 0. 1% mercuric chloridefor 10 min and rinsed with sterile water for four times. The optimal germination medium was MS medium supplemented with0. 2 mg/L6-BA and 1. 0 mg/L GA3. The optimal proliferation medium was MS medium supplemented with 0. 1 mg/L NAA and 0. 5 mg/L6-BA. The optimal rooting medium was MS medium supplemented with 1. 0 mg/L NAA. Through experiments,the medium formulations of different stages of tissue culture were screened to establish a system of dandelion tissue culture.
Keyword: Taraxacum borealisinense; polysaccharides content; multiplicationrate; drymattercontent;
华蒲公英（Taraxacum borealisinense Kitam.）为菊科蒲公英属植物，又名碱地蒲公英、硷地蒲公英，为多年生草本植物，有较强的环境适应能力。在我国主要分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、陕西、甘肃、青海、河南、四川、云南、江苏等地。华蒲公英属盐生植物，适应性强，耐寒、耐热、耐酸碱、耐瘠薄性均极强[1].
华蒲公英甘、苦、寒、五毒，同蒲公英，归肝、胃经。现代药理表明，蒲公英具有良好的抗菌作用，是天然抗菌剂的重要来源之一。华蒲公英可食部分达到84%,且含有多种营养物质和具有保健作用的化学物质[2],在我国一些地区将华蒲公英作为蔬菜食用，如江苏盐城。蒲公英（Taraxacum mongolicum Handel-Mazzetti）、药用蒲公英（Taraxacum officinale Weber）[3]等的植物组织培养已有报道，但针对华蒲公英的组织培养还未见相关报道。本文将参考蒲公英属其他种的组织培养方法，并针对华蒲公英的特性，对其进行组织培养相关技术的研究。
1、材料与方法
1.1、 材料
蒲公英种子采自盐城市大丰港地区，经南京工业大学陈集双教授鉴定为华蒲公英。选取120颗成熟饱满的蒲公英种子作为实验材料。
1.2、 方法
1.2.1、 蒲公英种子消毒
配制培养基：MS+0.5 mg/L GA3+0.2 mg/L6-BA+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂pH 6.0,该配方通过前期预实验获得，灌装到350 m L的组培瓶中，每瓶30 m L,并经高压蒸汽灭菌（121℃20 min）冷却后备用。
用滤纸包裹蒲公英种子，在超净台内进行消毒：75%乙醇浸泡30 s,无菌水清洗2次；再用0.1%升汞浸泡1、10、15、20 min,无菌水清洗5次，接种于培养基上，并置于温度（25±1）℃的培养室中暗培养15d,观察记录各组污染率及种子萌发情况。
1.2.2、 萌发培养基筛选
配制基本培养基MS+蔗糖30 g/L+琼脂5 g/L pH6.0,添加植物激素6-BA0.2 mg/L、GA3（0、0.5、1、2 mg/L），灭菌后备用。种子经外植体消毒后接种到培养基中，每瓶接种5颗，每个实验组10瓶。置于培养室中进行培养：温度（25±1）℃，暗培养5 d后进行光照培养（光照度1800~2000 Lux、光照周期14 h/d），培养时间为35 d,每间隔5 d统计并记录每组发芽个数并绘制折线图。
1.2.3、 增殖培养基筛选
增殖培养选择MS固体培养基，针对NAA设立0、0.1、0.5、1.0 mg/L 4个浓度梯度，每组10株，并按加入0.5 mg/L 6-BA,30 g/L蔗糖，5 g/L琼脂，调节pH到6.0,灭菌后备用。将萌发的无菌苗切去根部并接种在培养基上，置于温度（25±1）℃，光照度1800~2000 Lux,光照周期14 h/d的培养室中培养40 d.计算增殖率、干物率等。
1.2.4、 生根培养基筛选
生根培养基选择1/2 MS为基本培养基，设立不同NAA浓度的0、0.1、0.5、1.0 mg/L 4个梯度，每组10株，并添加活性碳（AC）0.1 g/L,30 g/L蔗糖，5 g/L琼脂，调节pH到6.0,灭菌后备用。将增殖培养获取的丛生苗在超净台中切成单株接种到培养基中，置于温度（25±1）℃，湿度，光照强度1800~2000Lx,光照周期14 h/d的培养室培养40 d.测量根长、株高、叶片长宽，测定干物率和多糖含量[4].
1.2.5、 数据分析
使用Excel进行数据处理，用SPSS 22.0数据处理软件进行显着性分析。
2、结果与分析
2.1、 蒲公英种子外植体消毒条件筛选
升汞（浓度0.1%）消毒时间对种子萌发和污染情况的影响见表1.结果表明，萌发率最高的组别为0.1%升汞消毒10 min,此时污染率最低且萌发率最高；升汞消毒只有1 min的组别出现污染，说明时间过短，消毒不彻底；升汞消毒时间在15 min及以上的组别均无种子萌发，可能是升汞毒性过大使外植体受损从而无法萌发。所以，考虑到乙醇的强透过性及升汞的毒性，消毒时间应控制在合理范围内，因此蒲公英种子最适宜的外植体消毒方案是：75%酒精浸泡30 s,无菌水清洗2次，再用0.1%的升汞浸泡10 min,无菌水清洗5次。
表1 不同0.1%升汞消毒时间下组别间萌发率及污染率差异
2.2、 萌发培养基的筛选
实验表明不加赤霉素的空白组别相比，其余组别的萌发数几近高出一倍（图1），且通过图3对比发现高浓度赤霉素组的叶片更大，说明赤霉素有促进芽萌发和叶片生长的作用；前10天赤霉素含量0.5 mg/L与2.0 mg/L的组别萌发数一致，10~30 d内0.5 mg/L的组别萌发率更高，但在后期与2.0mg/L组别一致，说明促进种子萌发的激素浓度不宜过高；GA3浓度1.0 mg/L的组别萌发率最高，其萌发速率最快的时期在10~25 d,后趋于稳定。
图1 不同赤霉素浓度的萌发情况
Fig.1 Effect of different contents of GA3 on germination rate
如图2,实验结果最好的组别为GA3浓度1.0mg/L.
2.3、 增殖培养基的筛选
经过40 d的培养，蒲公英丛生苗数量显着提升。每间隔10 d进行观察统计，所有组别从第10天起幼苗开始生成愈伤组织和分化形成不定芽，随后不定芽数逐渐增多并不断生长。通过观察发现，不含NAA的组别株高较其他组别更低，芽数少；NAA浓度0.1 mg/L的组别长势最好；高浓度组别由于NAA的促进细胞分裂作用，易形成更多颗粒状、质地疏松的愈伤组织，但分化出的不定芽较低浓度NAA更少，如图3.
植物激素NAA的不同浓度对华蒲公英丛生苗增值的影响见表2,结果显示，激素浓度NAA=0.1mg/L时，组培苗的平均鲜重最高，但其干物率相较于高浓度NAA组别低，与不加NAA的组别相似。说明NAA浓度为0.1 mg/L时丛生苗的含水量高，代谢旺盛，是生长状态最佳的浓度梯度组别。随着NAA浓度的增加，干物率呈上升趋势，与不含NAA的组别相比鲜重有所增加但增量逐渐降低，说明NAA只有在适宜浓度下才有最好的促生长作用。
表2 不同浓度的NAA对增殖丛生苗鲜重和干物率的影响
2.4、 生根培养基的筛选
2.4.1、 外观及增殖情况
不同的激素浓度对组培苗生根培养的影响见图4,随着NAA浓度的增加，蒲公英根粗增加，不定根数目增多，可大大提高移栽成活率；表3,平均根数随NAA浓度升高而增加，但根长变短。根长与株高、蒲公英叶片数无必然联系。NAA=0.5 mg/L时叶片长宽比最大，为17.9%且不定根数目增多。
图2 不同赤霉素浓度芽的萌发情况；
Fig.2 Effect of different contents of GA3 on germination rate
a.GA3=0（mg/L）；b.GA3=0.5（mg/L）；c.GA3=1.0（mg/L）；d.GA3=2.0（mg/L）
表3 不同浓度NAA下生根植株的生长状态
图3 蒲公英40天内增殖状况；
Fig.3 Taraxacum borealisinenseproliferation within 40 d
a.接种第1天；b.生长10天；c.生长20天；d.生长30天；e.生长40天1:NAA=0（mg/L）；2:NAA=0.1（mg/L）；3:NAA=0.5（mg/L）；4:NAA=1.0（mg/L）
与对照组无激素的培养基相比，高NAA浓度的组别鲜重较高，可超出3倍；但干物率最低（表4），说明植株的含水量高，即新生幼嫩组织多，进一步印证了NAA有促进细胞分裂并加速植株代谢的功能。
干物率最高的组别是NAA浓度0.1 mg/L,与其他实验组具有显着性差异。
表4 不同NAA浓度对生根苗鲜重和干物率的影响
图4 不同浓度NAA下蒲公英生根情况
Fig.4 Rooting of Taraxacum borealisinense under different concentrations of NAA
1 NAA=0（mg/L）；2 NAA=0.1（mg/L）；3 NAA=0.5（mg/L）；4 NAA=1.0（mg/L）
2.4.2、 多糖含量
大量资料显示，蒲公英的多糖主要集中在根部，可占到干重的40%~50%,其次是茎、叶，约有10%.壮苗培养基的主要目的是促使植株形成更多、更粗壮的根部，以便提高在后续移栽等过程中的成活率。因此，多糖的含量为生根培养基的重要衡量标准。由表5,NAA浓度越高，多糖在植株鲜重及干重中的比例也越高。当NAA浓度为0.5 mg/L和1.0 mg/L达到最高，与低浓度的NAA存在显着的差异。
表5 不同NAA浓度对生根苗多糖含量的影响
3、结论与讨论
1）以华蒲公英种子为实验材料进行无菌消毒，采用75%的乙醇与0.1%的升汞联合消毒，固定乙醇的浸泡时间30 s,筛选出升汞的浸泡时间为10min,高于该时间种子未出现污染，但也未萌发，原因是升汞浸泡时间过长对华蒲公英种子的胚体毒害较大。华蒲公英种子消毒的过程为首先将种子清水洗净，其次在超净台中用75%的乙醇浸泡30 s,无菌水冲洗2次，最后再用0.1%的升汞浸泡10 min,无菌水冲洗5次。由于蒲公英的种子太小浸泡消毒很不便，因此将种子包裹在单层纱布中进行消毒。
2）赤霉素（GA3）是一种高效调节植物生长的激素，它通过促进细胞数量的增加个细胞伸长而促进植物的生长发育。在农业生产中GA3多被用作打破种子休眠促进种子萌发，如陈艺芳等[5]研究表明一定浓度GA3能够促进沙氏鹿茸草种子的萌发，牛宋芳[6]等发现GA3与盐交互作用能够促进红砂种子的萌发，代建丽等[7]研究表明在白及种子的无菌培养中，0.5%的GA3能够促进其萌发，萌发率高达90%.本文在MS培养基中添加不同浓度的GA3,发现当GA3的浓度为1.0 mg/L华蒲公英种子的萌发率最高，后期的组培苗的长势也较好。
3）在华蒲公英的增殖培养中，我们筛选出了最佳的激素配方是NAA 0.1 mg/L、6-BA 0.5 mg/L.NAA与6-BA的不同组合广泛的应用在植物组织培养中的增殖或诱导丛生芽培养，如贾明良等[8]对半夏的组织培养中，发现当NAA的浓度为0.05 mg/L、6-BA 1.0 mg/L时，组培苗的增殖率最高、长势最好。唐蓉等[9]发现在试管培养蒲公英（T.mongolicum）芽形成阶段6-BA和KT与NAA或IAA结合使用时比单独使用6-BA和KT效果更为显着。
4）在华蒲公英的生根培养中，我们采用的是1/2MS为基础培养基，并添加活性炭（AC）（0.3 mg/L），优化了NAA的浓度为0.5 mg/L时生根苗长势最好，其组织内的可溶性多糖含量也较高，植物内的多糖与植物的抗逆性正相关[10],说明该浓度下培养的华蒲公英生根苗移栽后成活率较高。
参考文献
[1]马丽贤，董宽虎.盐碱胁迫对华蒲公英质膜ATP酶和5'-核苷酸酶的影响[J].草地学报，2010,18（4）：556-559.
[2]孙怀娟，魏小弟.蒲公英的组织培养研究[J].热带农业科学，2008,28（3）：4-7.
[3]陈华，李平，刘晶，等.药蒲公英再生体系的建立和优化[J].生物工程学报，2005,21（2）：244-249.
[4]张本厚，胡燕花，金磊磊，等.铁皮石斛组培体药用和营养成分含量的比较[J].江苏农业科学，2015,43（10）：324-327.
[5]牛宋芳，王利娟，刘秉儒.赤霉素对盐胁迫下红砂种子萌发的影响.草业学报，2017,26（6）：89-97.
[6]陈艺芳，郭巧生，朱再标，等.赤霉素浓度和温度对沙氏鹿茸草种子萌发影响研究[J].中药材，2018,5:1040-1043.
[7]代建丽，张露，郭鲜蒲，等.赤霉素及光照对白芨种子无菌萌发的影响[J].种子，2016,7:18-21.
[8]贾明良，方荷芳，张本厚，等.三叶半夏丛生块茎途径扩繁及分离技术研究[J].中国农业科技导报，2016,18（6）：181-186.
[9]唐蓉，韦梅琴，熊增宏.蒲公英试管培养中芽形成的研究[J].青海大学学报（自然科学版），2005,23（2）：62-65.
[10]黄俊哲，马宏宇，李永飞，等.西北地区黑果枸杞抗逆行研究进展[J].安徽农业科学，2017,45（15）：132-133.
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