将下一代测序与内镜逆行胰胆管造影相结合改善了恶性胆管狭窄患者的检测和管理 本文简介：
将下一代测序与内镜逆行胰胆管造影（ERCP）获得的胆道标本相结合，改善了恶性胆管狭窄患者的检测和管理目的：尽管成像、血清CA19-9和病理评估有所改善，但鉴别良性和恶性胆管狭窄仍然是一个诊断难题。新一代测序（NGS）的最新发展为癌症的早期检测和管理开辟了新的机会，但迄今为止，尚未严格应用于胆道标本。
将下一代测序与内镜逆行胰胆管造影相结合改善了恶性胆管狭窄患者的检测和管理 本文内容：
将下一代测序与内镜逆行胰胆管造影（ERCP）获得的胆道标本相结合，改善了恶性胆管狭窄患者的检测和管理
目的：
尽管成像、血清CA19-9和病理评估有所改善，但鉴别良性和恶性胆管狭窄仍然是一个诊断难题。新一代测序（NGS）的最新发展为癌症的早期检测和管理开辟了新的机会，但迄今为止，尚未严格应用于胆道标本。
设计：
我们前瞻性地评估了一个28基因NGS组（BiliSeq）使用内镜逆行胰胆管造影术
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获得胆管狭窄患者的胆道标本。评估血清ca19-9，病理评估和BiliSeq的诊断性能，对252例患者（57次实验和195次验证）进行了346例胆道标本的评估。
结果：
BiliSeq对恶性狭窄的敏感性和特异性分别为73％和100％。相比之下，升高的血清ca19-9和病理评估的敏感性分别为76％和48％，特异性分别为69％和99％。BiliSeq和病理评估的组合将敏感性提高到83％并保持99％的特异性。
BiliSeq对胆道刷的病理评估敏感性从35％提高到77％，胆道活检的敏感性从52％提高到83％。在原发性硬化性胆管炎（PSc）患者中，与病理评估相比，BiliSeq的敏感性为83％，病理评估的敏感性为8％。在20名（8％）患者中鉴定出治疗相关的基因组改变。两名ERBB2扩增的胆管癌患者接受了基于曲妥珠单抗的治疗方案，并具有可测量的临床放射学反应。
结论：BiliSeq联合胆道标本病理评估增加了恶性狭窄的检出率，特别是PSc患者。此外，BiliSeq确定可以对患者进行特定抗癌治疗分层的改变。
介绍：
涉及胆管的狭窄代表了一组异质性的良性和恶性疾病.1良性胆管狭窄可能是由于原发性硬化性胆管炎（PSC），IgG4相关性硬化性胆管炎，医源性损伤，感染等不太常见病因。恶性原因包括涉及胰胆管，壶腹壶腹，肝脏和很少转移性癌症的癌。然而，区分良性和恶性胆管狭窄可能是挑战性的，并依赖于临床检查，生化检测（如血清CA19-9），放射摄影成像，内镜手术和病理评估的多学科方法。考虑到某些良性狭窄的病因可能是恶性肿瘤的诱发因素，这种区分更为艰巨。例如，与一般人群相比，PSC与胆管癌的风险增加400倍相关。内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）通过定义形态学成像特征和疾病受累程度在评估胆管狭窄中发挥关键作用。然而，在透视期间没有看到可以区分良性和恶性的特征性特征。此外，直接胆管镜检查分级不准确，并且观察者一致性差。在ERCP期间，胆管刷和镊子活组织检查是病理学确认的首选方法;然而，检测恶性肿瘤的敏感性可在8％和67％之间，为了改进恶性条件的检测，开发了辅助技术，包括数字图像分析，KRAS突变检测和荧光原位杂交。然而，这些检测的灵敏度介于14％和60％之间。考虑到病理评估的低敏感性和可用的辅助研究，患者经常接受多种ERCP手术用于诊断并不奇怪。因此，恶性狭窄的治疗决策通常会延迟数周至数月，这使患者面临疾病进展的风险。相反，良性胆管狭窄的误诊可能导致不必要的手术切除。据报道，多达15％因疑似恶性肿瘤而接受手术的患者患有良性疾病。这种情况令人担忧，因为这些手术切除与相对较高的发病率和死亡率有关。因此，更多需要创新的术前方法来改善良性和恶性狭窄患者的分层。在过去的几年中，在理解肿瘤的基因组景观方面取得了显着进展或其次涉及胆管系统。全外显子组和全基因组测序研究报道了相对少数的致癌基因和肿瘤抑制基因的复发性基因组改变，如KRAS，TP53，CDKN2A和SMAD4。此外，这些基因组变异的一部分，如作为ATM和ERBB2，可以赋予对特定抗癌疗法的易感性。与此同时，新型分子诊断学的引入为术前标本的研究开辟了新的机会.35
36胆管标本通常以少量诊断材料为特征，由异质细胞群组成，可能模糊或模仿恶性肿瘤处理。因此，分子检测对于检测这些样本中的小比例突变细胞是高度敏感的。新一代测序（NGS）将高分析灵敏度与多基因分析相结合，因此是评估胆管狭窄的有吸引力的选择。在这项研究中，我们开发了一种高灵敏度，靶向的NGS测定，称为BiliSeq，用于28种基因，这些基因通常在涉及胆管系统的恶性肿瘤中发生突变，扩增和/或缺失。该测试在临床实验室改进修正案（CLIA）
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认证和美国病理学家学院（CAP）认可的临床实验室使用ERCP获得的胆管刷和/或活组织检查。不是从细胞学涂片/载玻片，酒精固定剂（例如，CytoLyt）或福尔马林固定的paraf-fin嵌入式（FFPE）组织中提取DNA，这可能会降低整体产量和质量，提交了专门的胆管刷洗和/或活组织检查在获得常规标本进行病理学评估后，直接进行BiliSeq检测。我们的目标是前瞻性地评估一大群患者的BiliSeq检测：（1）确定其检测恶性狭窄的准确性，（2）比较其作为其他诊断方式的辅助手段的表现，以及（3）评估在胆管标本中检测到基因组改变时对患者管理的影响。
患者人群：
患者人群来自匹兹堡医学中心（UPMC）的标准ERCP从2014年9月至2016年4月期间由胆管狭窄患者前瞻性收集57名患者的胆道标本训练队列，并由匹兹堡大学资助病理学系。完成培训队列后，2016年9月至2018年8月期间累计对195名患者进行了验证，并由Pitts-burgh大学精准医学研究所提供部分资助。总共收集163个胆道刷和172个胆道活检组织进行病理学评估，收集160个刷牙和135个活组织检查用于BiliSeq测试。胆管标本提交给UPMC解剖病理学实验室进行常规细胞病理学和病理学评估，UPMC分子和基因组病理学（MGP）实验室在ERCP程序24-48小时内进行BiliSeq检测。对医疗记录进行审查，以记录患者人口统计学，临床表现，ERCP发现，并发内镜超声（EUS）和EUS细针穿刺（FNA），血清CA19-9水平和相应刷牙的病理诊断和/或活组织检查。对重复ERCP手术进行单独分析，产生24个胆道刷和29个胆道活检，用于病理评估，24个刷牙和27个活组织检查
BiliSeq测试。狭窄的病因基于手术切除的样本或活检标本（尸检，开腹或腹腔镜手术切除/活组织检查，经皮穿刺或ERCP获得性胆道活检）的诊断病理学（n
=
145）和/或随访12个月后的临床标准（n
=
75）。由于报道的胆汁刷的特异性<100％，因此刷牙标本的病理评估结果不被视为诊断病理学。此外，ERCP阴性获得的活检不被认为是对良性病因的支持。如果重复成像或ERCP在随访12个月时记录了先前导管异常的分辨率或稳定性，则将狭窄指定为良性胆管病。相比之下，恶性肿瘤的临床诊断定义为在没有急性胆管病的情况下放射照相成像的质量，以及随访12个月后的临床或放射学进展，或临床和放射性死亡的临床诊断。图形确定是由于涉及胆管的恶性肿瘤。对于手术切除和活检标本，根据标准组织形态学标准进行诊断。在线补充表1中详细描述了诊断和临床随访信息，包括每位患者的随访方法。标本收集样本在ERCP过程中获得，包括细胞学刷，镊子活组织检查或两者。对于细胞学刷子，在狭窄部位采集多次往复运动的样品。使用的刷子用于细胞病理学检查，并置于15mL
ThinPrep
CytoLyt溶液（Hologic，Marlborough，Massa-chusetts，USA）中，并在24小时内转移用于样品处理。将单独的刷子用于BiliSeq测试并放入含有基于洗涤剂的DNA裂解缓冲液的收集瓶中。然后将收集瓶在24小时内运送到UPMC
MGP实验室并进行相应处理。类似的方法用于镊子生物活检，单独的活组织检查提交病理检查和BiliSeq测试。测试不需要最小标本细胞数。所有标本无论是刷牙还是活组织检查都是相同的。
biliseq测试：
NGS作为临床护理的一部分前瞻性地进行，并在UPMC
MGP实验室的10天内完成，该实验室通过了CLIA认证和CAP认证。使用MagNA
Pure
LC总核酸分离试剂盒（Roche，Indianapolis，Indiana，USA）在Compact
MagNA
Pure（Roche）上对刷洗和活检样品进行类似的基因组DNA分离。在提交刷牙和活检标本的情况下，将两个样本的DNA合并用于后续分析。使用dsDNA
HS测定试剂盒（Thermo
Fisher
Scientific，Waltham，Massachu-setts，USA）在Qubit
2.0荧光计上定量提取的DNA。基于扩增的靶向NGS用以下基因内的基因组区域引物（http：//
mgp.upmc.com
/
Applications
/
mgp
/
Content
/
OncoSeq_Hotspots.pdf）进行：AKT1，ALK，ATM，BRAF，
如前所述的CDKN2A，CTNNB1，EGFR，ERBB2，ERBB4，FGFR1，FGFR2，FGFR3，GNA11，GNAQ，GNAS，HRAS，IDH1，IDH2，KIT，KRAS，MET，NRAS，PDGFRA，PIK3CA，PTEN，SMAD4，TP53和VHL
.39对扩增子进行条形码化，纯化并用特定的衔接子连接。使用2200
TapeStation（Agilent
Technologies，Santa
Clara，California，USA）进行DNA量和质量检查。
Ion
One
Touch
2和One
Touch
ES用于制备和丰富模板，并通过半导体芯片上的离子球粒子进行测试。根据制造商的说明书（Thermo
Fisher
Scientific）在离子质子系统上进行大规模平行测序，并使用Torrent
Suite软件V.3.4.2进行分析，用于点突变，小插入/缺失和拷贝数改变。
。根据2017年分子病理学协会（AMP）/美国临床肿瘤学会（ASCO）/美国病理学家学会（CAP）联合共识指南，使用基于层次的系统解释癌症中的序列变异，对每个变体进行优先排序.40报告了第一级，第二级和第三级变体;但是，只有Tier
I和Tier
II变体用于后续分析。符合I级或Tier
II变体的基因组改变的存在被认为是一种“积极的”BiliSeq结果，而“BiliSeq”的结果被确定为缺乏第一级或第二级变体。检测的检测限为3％突变等位基因频率（AF）。测试的最小覆盖深度为500？
-
。对于鉴定的每个突变，基于突变等位基因与野生型等位基因的读数计算AF，并以百分比形式报告。如前所述进行拷贝数变异分析。基因扩增由如前所述存在≥6拷贝的变体，并使用荧光原位杂交（FISH）分析验证。
可靶向基因组改变的分类临床相关基因组改变被定义为目前市场上或注册临床试验中可用的抗癌药物靶向的改变。报告的激酶抑制剂可能靶向的基因组改变（在野生型KRAS，NRAS和HRAS基因组改变的情况下）包括：ALK，BRAF，EGFR，ERBB2，FGFR1，FGFR2，FGFR3和MET.43
-
46
ATM中的基因组改变可能针对基于铂的方案和聚（ADP-核糖）聚合酶抑制.47此外，已开发出对个体IDH1和IDH2突变具有高度特异性的药理学抑制剂。
统计分析本研究中使用的训练组的样本量估计/功效计算基于我们机??构中胆管狭窄的60％恶性肿瘤患病率，以及使用ERCP获得的标本的病理评估检测恶性肿瘤的相应40％敏感性。因此，至少50名患者的样本量将产生>
80％的功率，α为0.05。使用Fisher精确检验二分类变量来比较评估突变状态差异的统计分析。对于训练组，使用Youden指数生成接收器操作特征（ROC）曲线以比较生物标记物性能并建立截止水平。选择最终截止值以使通过梯形方法计算的曲线下面积（AUC）最大化。然而，还考虑了生物学原理和模型的简单性。对于确诊诊断病理学的病例，使用标准2×2列联表计算灵敏度和特异性。除非另有说明，重复测试不用于计算个体的敏感性和特异性生物标志物。使用SPSS
Statistical软件，V.25（IBM，Armonk，New
York，USA）进行所有统计学分析，并将统计学显着性定义为p值<0.05。
结果：
血清CA19-9的表现，病理评估和培训和验证队列中的biliseq测试57名接受ERCP治疗胆管狭窄的患者的培训队列前瞻性地进行生物标志物分析，并总结在表1，在线补充数据和表1中用于病理评估和BiliSeq测试的血清CA19-9研究，胆管刷和/或活组织检查对57名（98％）患者中的56名进行，其中只有一名患者在临床表现时未进行CA19-9测量。
。考虑到缺乏共识CA19-9截止值作为恶性狭窄的标志物，进行了CA19-9水平的探索性研究（在线补充图1）。通过ROC曲线分析，血清CA19-9可区分恶性与良性狭窄，AUC为0.727。在使用Youden指数选择≥45U
/
mL的阈值时，升高的CA19-9对检测到恶性的敏感性为62％，特异性为77％（表2）。在ERCP期间获得的用于病理学评估的标本包括22名（39％）患者的胆道刷，22名（39％）患者的胆道活检以及13名（22％）患者的胆道刷和活组织检查。对于腺癌至少可疑的病理诊断与恶性肿瘤的敏感性和特异性分别相关46％和100％。还提交了配对但独立的胆道刷和/或活组织检查样本用于BiliSeq测试。然而，对于同时进行病理评估的13例刷牙和活检标本的患者，只有2名患者进行了配对刷牙，并获得了用于BiliSeq检测的活检标本。对于剩余的11名患者，提交了相应的刷牙标本，但未提交活检标本，用于BiliSeq测试。总共有来自57名患者的59个胆管标本由BiliSeq评估。基因组改变仅在恶性狭窄中检测到，而在良性胆管病变的病例中不存在（图1）。
BiliSeq鉴定的基因组改变的敏感性和特异性分别为63％和100％。前瞻性收集验证队列，由195名患者组成，其中163名（84％）患者接受了随访（在线补充数据和表1）。在出现时对163名（88％）患者中的144名患者测量血清CA19-9。提交用于病理评估的标本包括49名（30％）患者的胆道刷，57名（35％）患者的胆道活检以及57名（35％）患者的胆道刷和活组织检查。还提交了成对但独立的刷牙和/或活检标本用于BiliSeq测试。对于同时进行病理评估的57例刷牙和活检标本患者，27例（47％）也有单独的刷牙和活检标本进行BiliSeq检测。在剩余的30名患者中，分别为24名患者和6名患者获得了相应的刷牙或活组织检查，用于BiliSeq测试。共有来自163名患者的190个胆管标本进行了BiliSeq测试。根据≥44U
/
mL的临界值，验证组内血清CA19-9对至少高级胆道发育不良的敏感性为81％，特异性为65％（表2）。与训练组相似，病理评估和BiliSeq测试的表现分别与49％和98％，76％和100％的敏感性和特异性相关。对包括220名随访患者的训练组和验证组进行的总体分析显示血清CA19-9，病理评估和BiliSeq检测的敏感性和特异性分别为76％和69％，48％和99％，73％和100％。病理评估和BiliSeq测试的组合将两种测定的灵敏度提高至83％并保持99％的高特异性。在病理学评估和BiliSeq测试中加入血清CA19-9进一步将敏感性提高到95％，但特异性降低至68％。对胆管标本亚型的分析，PsC的历史和重复ErCP与生物标志物检测共132个胆管刷和114个胆道活检组配对病理评估和BiliSeq检测（表3）。胆道刷和胆道活检病理评估的敏感性和特异性分别为35％和98％，52％和100％。相比之下，胆汁刷和胆道活检的BiliSeq测试分别与71％和75％的更高灵敏度相关，并且特异性为100％。在114例胆道活检中，28例通过数字胆管镜检查获得，其余标本通过胆管造影获得。没有统计学意义
在胆管镜引导和胆管造影引导的胆道活检中确定了敏感性和特异性的差异（在线补充表2）。对29名患者提交了用于病理评估和BiliSeq测试的匹配胆道刷和胆道活检标本。对于这些病例，刷洗和活组织检查的病理评估以及BiliSeq对刷牙和活组织检查的测试的敏感性分别为26％，39％，70％和78％，特异性为100％。
EUS-FNA可以改善恶性远端胆管狭窄的诊断。总共有141例患者接受了远端胆管狭窄和并发EUS，对86例患者和FNA进行了61例患者。在61例并发ERCP和EUS-FNA的患者中，基于ERCP获得的胆道标本和EUS-FNA标本的病理评估，检测恶性远端胆管狭窄的敏感性和特异性分别为59％和95％，58分别为％和100％。相比之下，BiliSeq测试产生的敏感性为76％，特异性为100％。此外，将获得ERCP的标本和BiliSeq检测的病理评估相结合，对恶性肿瘤的敏感性为90％，特异性为95％。加入EUS-FNA评估后，敏感性增加至93％，特异性保持在95％。
220例（17％）患者中有37例有PSC记录。该队列包括12个胆管狭窄，至少高级胆道发育不良和25个胆管狭窄伴良性胆管病。根据美国肝病研究协会（AASLD）指南，血清CA19-9>
129
U
/
mL，在这一高风险人群中，疑似胆管癌是一种标志物.50因此，基于129
U
/
mL的临界值，血清CA19-9与至少高级胆汁的敏感性为67％，特异性为84％。发育不良。病理评估的敏感性仅为8％，特异性为100％。相比之下，BiliSeq测试的灵敏度和特异性分别为83％和100％。将血清CA19-9与BiliSeq测试相结合将灵敏度提高至92％，但将特异性降低至84％。对BiliSeq测试添加病理学评估并未改善单独BiliSeq的敏感性。对220名（9％）患者中的20名（在线补充表3）进行了用于病理评估和Biliseq测试的重复ERCP，其具有胆道刷和/或活组织检查。对于16名患者重复该过程一次，对于两名患者重复该过程两次，对于两名患者重复三次。在随访的基础上，15名患者患有严重狭窄，5名患者患有良性狭窄。在15例恶性狭窄患者中，8例患者的BiliSeq检测到初始和重复胆管的基因组改变。然而，初始胆道刷和/或活组织检查的相应病理评估对于恶性肿瘤是阴性的。事实上，8例恶性狭窄中有5例从未出现至少可疑的恶性肿瘤术前诊断。对于剩下的7名患者，通过BiliSeq测试对两名患者进行病理评估和可检测的基因组改变（“阳性”），重复生物标志物测试为恶性。病理学为阴性，但BiliSeq对两名患者为阳性;两种诊断方式对一名患者均为阴性。重复ERCP的包含略微增加了病理评估的敏感性和特异性，BiliSeq测试和组合两种测定分别为51％和99％，75％和100％，以及87％和99％。成对的ErCP获得的胆管标本和诊断病理标本的比较biliseq测试诊断病理学材料可用于220名（66％）患者中的145名，包括134名恶性肿瘤和11名良性胆管病。对134例（40％）恶性肿瘤中的54例（在线补充表4）在诊断病理学标本上进行BiliSeq测试。在所有54例患者中检测到基因组改变，其中还包括12例ERCP获得的胆管标本，这些标本对BiliSeq的基因组改变呈阴性。在剩余的42个肿瘤中，4个病例的基因组谱不同，其中包括比使用ERCP获得的胆管标本的BiliSeq检测到的基因组改变。治疗相关的基因组改变和治疗数据根据先前报道的可行目标和化疗反应的预测标志物，对ERCP获得的胆管标本进行BiliSeq检测，确定了150例（13％）癌症中20例的治疗相关基因组改变（在线补充图2）
）。涉及受体酪氨酸激酶（RTK）/
Ras
/丝裂原活化蛋白（MAP）激酶信号通路的基因改变，包括ERBB2（n
=
6），MET（n
=
4），ALK（n
=
2），FGFR2在大多数情况下（n
=
13,65％）检测到（n
=
3）和FGFR3（n
=
2）。在ATM（n
=
2），IDH1（n
=
1）和IDH2（n
=
2）中发现了其他可能可行的改变。在ERBB2改变的恶性肿瘤中，两名患者（其腺癌具有ERBB2拷贝数增加）接受针对HER2
/
neu的靶向化疗而不是单独的标准化疗。第一位患者是一名老年妇女，患有黄疸，腹痛加剧一周，肝功能检查升高，血清CA19-9为55
U
/
mL，CT扫描显示胆结石和肝内胆管扩张。
ERCP显示肝内胆管狭窄，用于病理评估和BiliSeq测试。胆道刷的病理评估显示高度不典型的上皮细胞，可疑于腺癌。然而，BiliSeq测试检测到ERBB2拷贝数增加和TP53突变（p.C242fs
*
5和c.723delC）。在2周内，随后的三期CT扫描显示，在段4B
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5中有2.1cm的转移性肝脏病变（图2A），并且她的血清CA19-9为422.4U
/
mL。在重复ERCP后，确认恶性肿瘤，胆管刷和活组织检查均为侵袭性中分化腺癌。临床上认为是肝内胆管细胞癌，患者开始使用吉西他滨，顺铂和曲妥珠单抗。治疗3个月内，她的血清CA19-9降至14
U
/
mL，转移性肝脏病变降至0.6
cm。此外，随访ERCP指出患者胆管狭窄的改善（在线补充图3）。在诊断一年后，患者目前活得很好。她的血清CA19-9继续处于正常范围内，并且转移性病变的最大尺寸为0.3cm（图2B）。第二名患者（在线补充表1，患者166）是一名中年男性，患有黄疸，上腹痛，肝功能检查升高，血清CA19-9升高2383
U
/
mL，肺门周围胆管增厚关于MRCP和肝门部严重的MRCP。在ERCP和胆管刷上确定了铋IIIa狭窄，并且活检对于腺癌是阳性的。患者相应的BiliSeq测试显示ERBB2的拷贝数增加和TP53和CDKN2A的拷贝数丢失。该患者被转诊进行肝移植，但进一步检查发现在7/8段内有2.6
cm的转移灶（图2C）。在血清CA19-9为7959
U
/
mL时，患者开始使用吉西他滨，顺铂和曲妥珠单抗治疗临床周围胆管癌。
3个月后，患者的血清CA19-9标准化至9.4
U
/
mL。诊断后8个月，患者目前活得很好。他的血清CA19-9继续处于正常范围内，并且转移病灶在最大尺寸下降至0.7cm（图2D）。
讨论：尽管在横断面成像，血清研究，内镜技术和病理评估方面有所改进，良性和恶性胆管狭窄之间的区别仍然是一个诊断难题。在目前的研究中，我们开发并独立临床验证了靶向NGS检测，用于评估胆管狭窄。我们发现我们的靶向NGS检测BiliSeq比单独的病理评估具有更高的敏感性（73％对48％）和更高的特异性（100％对99％），用于检测至少涉及胆管的高度胆道发育不良。此外，两种测试（BiliSeq和病理评估）的组合比单独测试（83％）具有更高的灵敏度，同时保持高特异性（99％）。迄今为止，一些研究已经研究了靶向NGS在胆管狭窄中的应用。最近，Bankov等人发表了一项与BiliSeq类似设计的NGS检测结果，采用回顾性队列分析了16例不确定胆管活检和胆管癌的患者随访。作者未评估胆道刷洗标本和获得的NGS
DNA从FFPE组织块中提取。该作者承认，由于来自FFPE组织的低输入和低质量的DNA，后续分析需要DNA富集技术。虽然良性对照组未用于比较，但其测定的灵敏度为81％，这与BiliSeq相当。
Dudley等报道了对胆管标本的NGS检测的更全面的评估。作者评估了73个胆管和8个主要胰管刷牙标本的队列。与Bankov等人相反，他们的研究队列不包括胆管生物学。此外，不是获得专门的DNA分离刷，而是从CytoLyt保存的标本中提取DNA。由于酒精固定可能导致DNA降解，因此73个（11％）刷牙标本中的8个未通过NGS测试并不出乎意料。在我们的研究中，没有胆道刷牙和/或活检标本未通过BiliSeq测试。无论如何，在剩下的65个胆道刷牙标本中，Dudley等报道的敏感性为68％，特异性为97％，优于病理评估。然而，作者确定了一个假阳性结果。对于这种情况，NGS检测后的随访时间不清楚，并且根据作者，不能排除胆管系统内发育不良的可能性。尽管BiliSeq未发现任何假阳性病例，但在重复检测后仍有37例（25％）假阴性病例。为了确定假阴性NGS结果的原因，我们对这37种恶性肿瘤中的12种可用的诊断病理材料进行了BiliSeq检测。在我们的分子组中检测到28个基因中至少一个的基因组改变。考虑到胆管标本的采集在技术上是困难的并且已知采样失败发生，对狭窄的采样不充分可能是可能的解释。或者，低标本肿瘤细胞性也可能是一个因素。我们的NGS测定的最低检测限是突变等位基因的约3％，或者对于杂合突变，例如KRAS，6％的肿瘤细胞性。因此，如果肿瘤细胞的比例低于6％，那么BiliSeq将无法检测致病基因组改变。虽然这一发现可被视为技术限制，但控制BiliSeq的敏感性可能是有益的，特别是对于特定基因。以前使用手术切除材料的研究证实了低度胆道发育不良和良性胆管病变的KRAS突变.52因此，增加BiliSeq对KRAS突变的敏感性可能导致至少高级胆道发育不良的特异性降低。同样重要的是要强调涉及胆管的一部分恶性肿瘤可能包含未经我们的测试分析的基因组改变。例如，染色质重塑基因（如ARID1A）和FGFR2融合基因的突变存在于高达20％的肝内胆管癌中。因此，BiliSeq的敏感性可能通过靶扩增得到改善/富集技术和扩展的基因组。我们研究的另一个有趣但初步的观察结果是，BiliSeq与PSC患者中至少高度胆道发育不良的病理评估之间的敏感性存在显着差异。
PSC是一种自身免疫疾病，与胆管癌的终身发病率相关，范围从6％到36％.53-56在PSC诊断的前2年内，胆管癌的风险最高，并提示早期可能的机会窗口然而，在炎症性狭窄的背景中的小胆管癌特别难以通过病理评估进行取样和挑战以进行诊断。虽然我们队列中PSC患者的数量相对较少，但病理评估的敏感性仅为8％。
相比之下，BiliSeq对至少高度胆道发育不良的敏感性达到了83％，并提供了令人信服的证据，以进一步探索其改善这一高危患者人群临床结果的潜力。除了NGS测试外，临床上还开发了几种辅助技术来评估胆管狭窄，例如数字图像分析，单基因测序和用于染色体多体性的多焦点FISH。在这些辅助研究中，多色FISH已成为许多学术机构十多年来采用的工具.15类似于BiliSeq，多色FISH的前提是发现涉及胆管的发育不良和恶性肿瘤常常以高频率为特征数字染色体异常。然而，在过去几年中，该测试通常只能实现35％-60％的灵敏度，而技术改进最小.13
15
18多色FISH价格昂贵，劳动强度大，容易出现主观解释错误，需要大量的技术专业知识。事实上，多色FISH的解释需要经验丰富的病理学家，因为需要对样本进行成对的形态学评估以确保正在评估感兴趣的上皮细胞的染色体异常。虽然我们没有对BiliSeq和多色FISH进行正式比较，但Dudley等[6]发现他们的NGS检测比多色FISH具有更高的敏感性。这并不奇怪，因为NGS测试检测到多个基因中的拷贝数改变和单核苷酸变体。此外，随着成本的降低和单次批量处理多个样本的能力，NGS测试已经广泛应用于学术和非学术机构。因此，在评估胆管标本时，NGS测试可能是比多色FISH更优选的选择。证明BiliSeq对ERCP获得的胆道标本的临床可行性也为NGS检测进一步应用于非侵入性标本类型（如胆汁和血清（如循环肿瘤DNA和外泌体））奠定了基础.58-61此外对于早期检测，广泛采用NGS技术的主要推动力是实体肿瘤基因分型。出现或二次涉及胆管系统的恶性肿瘤通常是顽固的，并且当前的标准化疗方案与有限的功效相关。在一线或二线化疗后的复发或进展中，对一部分肿瘤进行全面的基因组分析已经确定了可能作为特定治疗反应的可能靶向或预测标志物的改变[26]。例如，已报道肝内ERBB2扩增胆管癌，肺门周围/远端胆管癌和胆囊腺癌的患病率分别为5％，17％和19％.28在8例ERBB2扩增或HER2
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neu过度表达的胆囊腺癌患者中，Javle等[46]报道有3例患有胆囊癌。病情稳定，4例有部分反应，1例对靶向治疗（曲妥珠单抗或曲妥珠单抗与帕妥珠单抗）有完全反应。值得注意的是，8名患者中有5名在接受靶向治疗前接受了一线化疗或化学放疗。在我们的研究中，BiliSeq测试确定了两名ERBB2扩增患者：一名肝内胆管癌和一名肺门周围胆管癌。两名患者均接受曲妥珠单抗联合标准一线化疗（吉西他滨和顺铂），两者均表现出可测量的放射学反应和血清CA19-9的正常化，两者目前均存活且良好。虽然我们认识到标准化学疗法的好处，但似乎有理由认为在化疗方案中纳入曲妥珠单抗是负责任的。
对于在两个患者中观察到的显着和延长的治疗效果。还应该强调的是，在诊断时识别可靶向的改变有助于个性化的治疗方法。此外，ERBB2不是BiliSeq检测到的唯一可能赋予抗癌治疗易感性的基因组改变。我们承认这项研究存在一些局限性。尽管对大量胆管标本进行了分析，但仅66％的患者可获得随访诊断病理学。然而，大多数涉及胆管系统的恶性肿瘤患者通常在出现时具有不可切除的疾病或者是不良手术候选者。此外，为了确保用于NGS测试的足够的DNA，使用比用于病理评估的样本的单独的胆管样本进行BiliSeq测试。该协议可以解释病例评估和BiliSeq测试之间的一些病例的不一致结果。此外，本研究未涉及将基于NGS的分子检测与胆管狭窄评估相结合的最佳基因组或方法。为了最大限度地减少重复采样的需要，我们通常在初始ERCP时对所有具有潜在恶性病变的患者进行BiliSeq。
BiliSeq阳性结果加速了适当手术和/或肿瘤学专科医生的转诊过程。
BiliSeq阴性结果为阴性病理评估提供了额外的保证。由于这些诊断方式均未达到>
95％的敏感性，因此基于阴性BiliSeq，很少有患者可以完全免于监测。使用多色FISH的投资者采用了类似的方法。同样重要的是要认识到胆管镜检查的最新进展和EUS-FNA的使用增加可能会改善恶性肿瘤的检测。虽然本研究中的少数患者通过胆管镜检查进行评估，但我们发现了类似的诊断性能特征据报道，EUS-FNA应用于胆管狭窄，特别是远端狭窄，与传统ERCP方法相比，可增强组织采集。然而，我们研究队列中使用这两种技术进行评估的患者并未进行胆管镜检查和胆管造影。显示任何统计学上显着的敏感性差异。事实上，BiliSeq比单独的ERCP或EUS-FNA产生更高的敏感性，并且与任一种方法组合，将检测远端恶性狭窄的敏感性提高至至少90％。最后，我们对可靶向基因组改变的定义是基于无数研究的集合。在进行前瞻性临床试验之前，任何给定药物对特定基因组改变的真实临床效用是未知的。然而，我们能够通过将基因组改变（例如ERBB2扩增）与特异性抗癌疗法（例如曲妥珠单抗）配对来证明临床益处??的至少轶事证据。总之，我们报告了最大的前瞻性研究，以检验基于NGS的分子（BiliSeq）检测在评估胆管狭窄中的作用。我们的结果支持将BiliSeq与胆管标本的标准病理评估相结合的临床效用。此外，BiliSeq具有识别可靶向基因组改变的潜力，因此可以对特定化疗方案的患者进行分层。然而，未来的研究需要探索将BiliSeq和类似的基于NGS的检测方法整合到胆管狭窄患者的当前监测和管理指南中。
将下一代测序与内镜逆行胰胆管造影相结合改善了恶性胆管狭窄患者的检测和管理 本文关键词：胆管，造影，逆行，相结合，狭窄
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