土壤改良剂对草莓园土壤细菌群落结构的改变 本文关键词：土壤改良剂，群落，细菌，土壤，草莓
土壤改良剂对草莓园土壤细菌群落结构的改变 本文简介：摘要： 研究旨在探究不同土壤改良剂的使用对草莓种植土壤中细菌群落结构,细菌总数、细菌多样性的影响,为土壤改良剂的高效利用奠定基础。选择北京市两处草莓种植生态农场,通过施加土壤改良剂(EM菌,靠山多霸)于草莓种植土壤中,经一季草莓种植后,收集不同处理的土壤样品,利用高通量测序比较土壤改良剂对草莓种植土
土壤改良剂对草莓园土壤细菌群落结构的改变 本文内容：
摘 要： 研究旨在探究不同土壤改良剂的使用对草莓种植土壤中细菌群落结构, 细菌总数、细菌多样性的影响, 为土壤改良剂的高效利用奠定基础。选择北京市两处草莓种植生态农场, 通过施加土壤改良剂 (EM菌, 靠山多霸) 于草莓种植土壤中, 经一季草莓种植后, 收集不同处理的土壤样品, 利用高通量测序比较土壤改良剂对草莓种植土中细菌群落结构的影响, 从土壤微生物的角度探究EM菌、靠山多霸对草莓种植土壤的影响。研究结果显示:土壤调理剂的施用增加了土壤细菌总数, 改变了土壤细菌多样性, 同时也明显改变了不同分类水平下各类细菌所占比重。该研究证明土壤调理剂的合理使用对于提升土壤微生物多样性, 调整微生物群落结构, 进而促进植物生长具有潜在的利用价值。
关键词： 土壤改良剂; 草莓种植土壤; 高通量测序; 细菌群落结构;
Abstract： To investigate the effects of two soil amendments on bacterial community structure, the total number of bacteria and bacterial diversity of strawberry planting soil, soil samples were selected from two strawberry ecological farms in Beijing, treated with two different commercial soil amendments, namely effective microorganisms (EM) agent and Kaoshanduoba agent, before sowing. And the bacterial communities were analyzed by high-throughput sequencing method. The results indicated that two soil amendments increased the total number of bacteria, altered the activity of soil bacteria, and meanwhile changed the composition of the bacterial community. Our study demonstrated that soil amendments could increase total bacteria number, change planting soil bacteria diversity and structure, and had huge potential to promote plant growing.
Keyword： soil amendments; strawberry planting soil; high-throughput sequencing; bacterial community structure;
0、 引言
土壤改良剂是指用于改善土壤理化性质, 间接促进植物生长的物料, 主要作用于提升土壤肥效、增加作物产量等方面[1,2]。EM (Effective Microorganisms) 菌, 即有效微生物群, 于20世纪60年代研发, 90年代用于生产。其主要成分为光合菌类、乳酸菌类、酵母菌类、放线菌类等80余种微生物[3]。目前主要用于种植、养殖、环保等领域, 可有效促进植物生长、改善种植土壤性状, 增强植物抗逆性, 提高土壤酶活性, 已经被包括中国在内的全世界60多个国家、地区广泛使用[4,5,6]。土壤微生物是土壤的重要有机组成, 同时也是土壤生态系统中最为活跃的部分。土壤微生物对于环境的作用一方面体现在改善土壤质量, 提升土壤肥力, 另一方面在于调控土壤中植物的生长发育, 是评价土壤质量的关键生物学指标[7]。土壤细菌是土壤微生物重要组分, 约占其总量的70%～90%[8]。按照土壤细菌不同的形状可将其分为球菌、杆菌、螺旋菌等。根据土壤细菌的营养方式可分为自养、兼性自养与异养细菌[9]。不同土壤改良剂的加入, 不仅改善了植物生长状况, 同时也对种植土壤中的微生物群落结构, 微生物总量、多样性产生一定影响。本研究选择了北京市两处草莓种植生态农场, 通过施加土壤改良剂 (北京中科惠农技术中心生产的EM菌和山东靠山生物科技有限公司生产的靠山多霸微生物改良剂) 于草莓种植土壤中, 经一季草莓种植后, 收集不同处理的土壤样品, 利用高通量测序技术, 针对使用不同改良剂的草莓种植土, 探究其细菌群落的变化情况。研究旨在解释土壤改良剂对草莓种植土壤细菌群落结构的影响, 以期为土壤改良剂的高效、绿色应用提供科学依据。
1、 材料与方法
1.1、 样品采集
用于测定土壤微生物群落结构的草莓种植土壤分别取自北京市顺义区地源遂航农庄草莓采摘园和北京市昌平区虫乐农庄草莓采摘园。其中地源遂航农庄处理包括:空白处理组 (S1) , EM菌添加组 (S2) , 靠山多霸添加组 (S3) ;虫乐农庄处理包括:空白处理组 (S4) , EM菌添加组 (S5) 。土壤调理剂按照说明书于种植之前施加至草莓种植土壤中, 所有土壤样品均为种植一季草莓之后的温室土壤。
1.2、 土壤细菌群落结构测定
准确称量10 g不同处理的土壤样品, 使用Power Soil DNA extraction试剂盒 (MO BIO Laboratories, Carlsbad, CA, USA) , 按照说明书步骤提取DNA, 并于-20℃环境下保存。
按指定测序区域, 合成带有Barcode的特异引物对样本的16S rDNA V4区域进行扩增:前端引物为515F (5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’) , 反向引物为806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) ;PCR在20μL的反应体系中进行, 包括:10xExTaq Buffer:5μL, dNTP (2.5 mmol/L) :4μL, 10 PM前向引物:2μL, 10 PM反向引物:2μL, DNA模板:25 ng (XμL) , ExTaq酶:0.25μL, 补水: (36.75-X) μL。
PCR反应参数为: (1) 94℃5 min, (2) 30个循环:94℃1 min, 48℃1 min, 72℃1 min, (3) 72℃10 min。
PCR扩增产物采用paired 150-bp MiSeq 2000测序系统 (Illumina) 进行配对末端测序, 采用Qiime软件平台 (v1.9) , UCLUST方法进行操作分类单元 (OUT) 聚类, OTU中序列相似性设为97%。试验在农田土壤污染防控与修复北京市重点实验室, 于2017年5—12月份进行。
2 、结果与分析
2.1、 土壤细菌群落组成分析
针对土壤细菌群落门水平上进行分析, 如图1所示变形菌门 (Proteobacteria) 在门水平上占主导地位, 且受到不同处理的影响, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:变形菌门所占比重由空白 (S1) 48.4%下降为42.7%, 加入靠山多霸 (S3) 变形菌门所占比重上升至52%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中变细菌门相对丰度由41.6%上升至49.2%。拟杆菌门 (Bacteroidetes) 在门水平上所占比重次之, 且受到不同处理的影响, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:拟杆菌门所占比重由空白 (S1) 14.9%上升为15.7%, 加入靠山多霸 (S3) 拟杆菌门所占比重下降至12.7%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中拟杆菌门相对丰度由5.7%上升至11.6%。酸杆菌门 (Acidobacteria) 在门水平上占据第三的位置, 同样受到不同处理的影响, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:酸杆菌门占比重由空白 (S1) 8.9%上升为15.2%, 加入靠山多霸 (S3) 酸杆菌门所占比重变化不明显 (8.8%) 。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中酸杆菌门相对丰度由16.1%下降至11.7%。
针对土壤细菌群落纲水平上进行分析, 图2所示α-变形杆菌纲 (Alphaproteobacteria) 在纲水平上占主导地位, 且受到不同处理的影响, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:α-变形杆菌纲所占比重由空白 (S1) 21.4%下降为15.1%, 加入靠山多霸 (S3) α-变形杆菌纲所占比重下降至18.2%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中α-变形杆菌纲相对丰度由14.9%上升至23.4%。γ-变形菌纲 (Gammaproteobacteria) 在纲水平上所占比重次之, 且受到不同处理的影响, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:γ-变形菌纲所占比重由空白 (S1) 13.5%下降为10%, 加入靠山多霸 (S3) γ-变形菌纲所占比重上升至20.5%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中γ-变形菌纲相对丰度由9%下降至8%。酸杆菌纲 (Acidobacteria) 在纲水平上占据第三的位置, 同样受到不同处理的影响, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:酸杆菌纲所占比重由空白 (S1) 8.2%上升为13.8%, 加入靠山多霸 (S3) 酸杆菌纲所占比重下降至7.6%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中酸杆菌纲相对丰度由12.9%下降至10.7%。
图1 门水平上添加不同改良剂后草莓种植土细菌相对丰度
图2 纲水平上添加不同改良剂后草莓种植土细菌相对丰度
针对土壤细菌群落目水平上进行分析, 图3所示鞘脂杆菌目 (Sphingobacteriales) 在目水平上占主导地位, 且受到不同处理的影响, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:鞘脂杆菌目所占比重受EM菌影响不大, 所占比重为9%～10%, 加入靠山多霸 (S3) 鞘脂杆菌目所占比重下降至5.7%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中鞘脂杆菌目相对丰度由2.7%上升至7.9%。红杆菌目 (Rhodobacterales) 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中受到不同处理的影响不大, 所占比重约为6%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中红杆菌目相对丰度由7%上升至8%。针对黄色单胞菌目 (Xanthomonadales) 进行分析, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:黄色单胞菌目所占比重由空白 (S1) 7.3%下降为4.3%, 加入靠山多霸 (S3) 黄色单胞菌目所占比重上升至15.8%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中黄色单胞菌目相对丰度变化不大, 约为2%～3%。
针对土壤细菌群落科水平上进行分析, 如图4所示红杆菌科 (Rhodobacteraceae) 在科水平上占主导地位, 且受到不同处理的影响, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:红杆菌科目所占比重受EM菌影响不大, 由空白6.9% (S1) 略微下降至6.1% (S2) , 加入靠山多霸 (S3) 红杆菌科所占比重略微下降至6.3%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中红杆菌科相对丰度由7.2%上升至8.5%。芽单胞菌科 (Gemmatimonadaceae) 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中受到不同处理的影响较大, 所占比重由空白组 (S1) 所占6%的比重经EM菌处理 (S2) 下降至4.8%, 靠山多霸处理后比重上升至7.2%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中芽单胞菌科相对丰度由5.5%上升至6.1%。针对鞘脂单胞菌科 (Sphingomonadaceae) 进行分析, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:鞘脂单胞菌科所占比重由空白 (S1) 为8%, 加入EM菌下降为3.1%, 加入靠山多霸 (S3) 鞘脂单胞菌科所占比重下降至6%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中鞘脂单胞菌科相对丰度由3%上升为6%。
图3 目水平上添加不同改良剂后草莓种植土细菌相对丰度
图4 科水平上添加不同改良剂后草莓种植土细菌相对丰度
针对土壤细菌群落属水平 (Photobacterium) 在属水平上所占比重次之, 且受到不同处理的影响, 在地源遂航上进行分析, 图5所示鞘脂单胞菌属 (Sphingomonas) 在属水平上占主导地位, 且受到不同处理的影响较大, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:鞘脂单胞菌属所占比重由空白 (S1) 7.7%下降为2.6%, 加入靠山多霸 (S3) 鞘脂单胞菌属所占比重下降至4.4%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中鞘脂单胞菌属相对丰度由2.8%上升至7.4%。发光杆菌属农庄所采取的土壤样品中:发光杆菌属所占比重由空白 (S1) 3%下降为2.5%, 加入靠山多霸 (S3) 发光杆菌属占比重下降至2%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中发光杆菌属相对丰度由3.4%下降至2.5%。溶杆菌属 (Lysobacter) 在属水平上占据第三的位置, 同样受到不同处理的影响, 在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:加入EM菌 (S3) 对于溶杆菌属所占比重影响不大, 加入靠山多霸 (S3) 变细菌门所占比重由1%上升至5%。在虫乐农庄采取的土壤样品中:相比与空白处理 (S4) 加入EM菌 (S5) 处理组中溶杆菌属相对丰度保持相对稳定 (0.3%) 。
2.2 、土壤细菌多样性分析
Chaol指数即用chaol算法估计样本中所含OTU数目的指数, 用于反映样本中微生物总数。香农-维纳指数是用来估算样本中微生物多样性指数之一。它常用于反映Alpha多样性, 值越大说明群落多样性越高。
如图6所示:在地源遂航农庄所采取的土壤样品中:加入EM菌 (S2) 靠山多霸 (S3) 菌提升了Chao1指数和香农-维纳指数, 即提升了土壤细菌总数与群落多样性。在虫乐农庄采取的土壤样品中:加入EM菌提升了Chao1指数同时降低了香农-维纳指数, 即提升了细菌总数, 抑制了群落多样性。
图5 属水平上添加不同改良剂后草莓种植土细菌相对丰度
图6 添加不同改良剂后草莓种植土细菌多样性指数 (A:chao1指数, B:香农-维纳指数)
3 、结论
土壤调理剂EM菌、靠山多霸作为高效土壤调理剂, 在调节植物生长的同时, 也改变了种植土壤微生物群落结构。高通量测序结果显示, 不同分类水平下, 两种土壤调理剂均改变了主要细菌所占比重, 提升了细菌总数, 改善了细菌多样性。两种土壤调理剂对于提升土壤微生物多样性, 调整微生物群落结构, 进而促进植物生长具有潜在的利用价值。
4 、讨论
EM菌和靠山多霸微生物改良剂是北方地区草莓种植常用的土壤改良剂, 在农业生产、特别是水果种植领域具有广泛的应用空间, 目前的研究多集中于其对植物生长的促进作用, 而针对其影响土壤微生物特别是细菌群落结构、多样性的研究较少。研究证明, 靠山多霸的施用可以有效改良土壤理化机构, 如提升土壤有机质含量、pH值、孔隙度, 降低土壤容重;同时显着提升花生、苹果、甜瓜等作物的产量与品质[10,11,12,13]。与之类似, 通过施用EM菌改良农田土壤, 可以有效促进植物根系的生长、提升根系活力、提升作物光合作用, 提升植物品质[14,15,16,17,18];同时改善土壤理化性状:提升土壤有机质、有效磷含量、土壤酶活性[6,19,20]。综上所述可以得出结论:土壤调理菌剂EM菌、靠山多霸的施用提升改变土壤理化性状, 改善细菌生存环境, 同时提升细菌数量, 改善植物生长微环境, 进而促进植物的生长。
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