海洋微生物资源多样性与应用分析 本文关键词：多样性，微生物，海洋，分析，资源
海洋微生物资源多样性与应用分析 本文简介：摘要： 海洋中的微生物蕴含着丰富的功能基因资源,对生物技术开发、新药合成、环保、可再生能源等领域的解决方案能提供灵感和方法,随着国际上对各种不同环境微生物组研究的开展,海洋微生物组的研究也日渐兴盛并取得了一系列的进展。本文将从海洋微生物多样性、微生物组研究方法、海洋微生物组功能及应用等方面综述该领域
海洋微生物资源多样性与应用分析 本文内容：
摘 要： 海洋中的微生物蕴含着丰富的功能基因资源,对生物技术开发、新药合成、环保、可再生能源等领域的解决方案能提供灵感和方法,随着国际上对各种不同环境微生物组研究的开展,海洋微生物组的研究也日渐兴盛并取得了一系列的进展。本文将从海洋微生物多样性、微生物组研究方法、海洋微生物组功能及应用等方面综述该领域的研究成果。
关键词： 海洋微生物组; 多样性; 研究方法; 应用;
Abstract： Microorganisms in the ocean contain rich functional genetic resources, which can provide inspiration and methods for solutions in the fields of biotechnology development, new drug synthesis, environmental protection and renewable energy. With the development of the marine microbiome, a series of advances have been made. This article summarizes the research results in this field from the aspects of marine microbial diversity, microbiome research methods, marine microbiome functions and applications.
Keyword： marine microbiome; diversity; research methods; applications;
0、 引言
海洋环境不同于陆地，是一个独特的生态环境，有高盐、高渗、高压、寡营养等特点，某些海域还存在高酸、高碱、缺氧、低温、高温、高辐射等特殊条件，与陆地的一些生态环境相比微生物的活动并不剧烈，但从海水表面到海底淤泥都存在非常丰富的微生物资源。海洋环境的复杂性造就了微生物多样性，在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起重要作用。海洋微生物群落与动物、植物、土壤中的或人体微生物群落有许多不同的特征[1]，其独特的遗传特性和适应机制成为基因库和生物活性物质的重要来源。《全国科技兴海规划（2016-2020年）》提出要打造海洋产业的新引擎，整合优化海洋药源生物种质、基因和天然化合物等资源库建设，发展产业需要的海洋药物筛选评价、海洋医药制备及制剂工艺技术等支撑平台，加快海洋微生物高通量原位培养新技术的应用，推动发现新的功能微生物，为海洋生物医药和功能性食品开发提供持续的资源保障。创新新型开发工业酶制剂、多肽制剂和工具酶产品、海洋微生物疫苗、抗菌、抗虫绿色兽药和抑菌防霉制剂这些规划的实现离不开对海洋微生物资源的深度挖掘。
海洋微生物组的研究不仅能完善人们对微生物种属和生命现象的认知，并且对开发其所蕴含的基因资源、酶资源、天然产物资源及发展生物技术都具有重大的推动作用。微生物组是指一个特定环境或生态系统中全部微生物及其遗传信息，包括生物体及基因组。在2017年由刘双江、赵国屏两位院士联合提出的“中国微生物组计划”中将海洋微生物组的研究纳入发展规划，提出要以微生物组的理念研究揭示海洋微生物的代谢、信号转导等机制，发展海洋微生物相关生物技术及大数据分析技术[2]。本文将在总结领域研究成果的基础上，从海洋微生物的多样性、研究方法、海洋微生物的功能及应用等方面入手，综述这一领域的研究进展，并对未来发展进行讨论和展望，希望能为该领域的研究人员及有兴趣进入该领域的科技人员提供较全面的视野，快速了解行业发展趋势。
1、 海洋微生物组的研究方法
1.1、 微生物培养技术
通过液体培养和平板培养对微生物进行分离、纯化和培养操作来获得微生物是经典微生物学研究单一微生物生理生化和遗传特性的基础，人们所了解的大部分关于微生物特性的知识基本依赖于对微生物培养水平，虽然目前可培养的微生物大多还不到50%，但是培养仍然是微生物学的基础。19世纪70年代人们建立无菌操作技术、细菌培养技术和纯种分离技术，随后Zobell最先开展海洋细菌的培养工作[3]，随着人们对海洋微生物特性和营养类型等的了解不断深入，开发出了多种典型培养基，使得越来越多的海洋微生物被分离。冀世奇等人[4]通过活细胞微球包埋技术进行海洋微生物高通量培养和分选获得了500株菌株，与平板分离获得的254株菌种进行对比分析，结果表明高通量法获得了更高的微生物多样性，并且能培养出平板法不能或不易分离到的类群，提高了微生物的可培养养性。微生物培养的主要策略是尽可能地模仿微生物生存的自然环境，例如模拟低营养、低氧、高二氧化碳等环境条件以及在培养环境中加入自然环境成分等方法。Connon等人通过模拟极低营养水平的海洋环境条件对海洋微生物进行高通量筛选获得了多种海洋新菌种[5]。Kaeberlein等人设计了一个仅对分子有通透性的扩散室，放入含有潮间带沉积物和海水的水族箱中进行培养，通过模拟自然环境，使得以前未培养的微生物能在琼脂培养基中生长，在纯培养条件下分离出具有代表性的海洋生物群落[6]。
1.2、 免培养技术
人们在采用平板培养微生物时发现能被培养微生物与环境微生物实际数量之间存大巨大差异，这可能是由于人们尚未准确了解环境微生物的生存条件如pH值、营养需求、代谢类型以及是否与其它微生物间有生存依赖等要求而造成的培养失败。单纯依靠培养技术并不能完全反映海洋微生物多样性的真实情况，可能造成具有应用潜力的微生物资源被遗漏。多年来人们一方面倾力发展微生物培养技术，另一方面开辟新径通过一些免培养策略从系统水平和原位单细胞水平规避培养难题对微生物进行研究，发展出了一系列面培养技术用于微生物资源发掘。例如基于16SrRNA/18SrRNA分析和新一代测序技术的系统分类标记法研究群落组成及结构，利用功能宏基因组学研究群落遗传潜能，利用宏转录组、宏蛋白质组学及代谢组学等技术研究群落的功能、真实的代谢情况及其在药物和食物成分代谢方面的影响，或是利用单细胞基因组测序及组装技术结合参考基因组进行同源聚类探究微生物分布特性的原因[7]。总的来说，免培养技术适用于多种环境中可培养及不可培养微生物的研究，对微生物新种的界定和发现、评价具有重要生态地位的种群及发掘未知微生物中的基因资源和特殊环境微生物群落的功能资源具有极大的优越性。
2、 海洋微生物资源多样性
海洋微生物是海洋中个体微小、构造简单的生物的总称，包括古生菌、细菌、放线菌、霉菌、酵母、病毒、衣原体、支原体、噬菌体、微型原生动物等。微生物系统学和高通量测序技术的快速发展促进了研究人员对海洋微生物多样性的认识。Tara Oceans expedition项目于2009年启动后，Sunagawa等用宏基因组学技术分析了Tara计划243个样品的宏基因组数据，生成一个含有4千万以上非冗余序列的海洋微生物参考基因库，大多数新序列主要是来自病毒、原核生物以及微型真核生物[8],de Vargas等人通过对从热带和温带海洋中划分的334个大小不同的有光线区域中获取的浮游生物群落样本的18SrRNA序列分析，对真核生物多样性进行评估，在目前所有的分类学水平上得到约11200个真核浮洲生物类群[9]。
2.1 、海洋古生菌
人们利用DNA序列技术研究原核生物之间的相互关系时发现了古生菌。海洋中的古生菌常生活在一些极端环境中，如浅海或深海的厌氧沉积物、热泉或深海热液喷口等地方。古菌的分类是16SrRNA序列分析为依据[10,11,12]。古菌在海洋中的数量和种类在不同海域、不同深度分布并不均衡。
2.2、 海洋细菌
海洋细菌是海洋微生物中分布最广、数量最大的一类生物。几乎所有已知生理类群的细菌都能在海洋中找到，包括光能和化能自养、异养、好氧及厌氧、寄生和腐生、浮游和附着等类型。海水中的细菌以革兰氏阴性菌占优势，海底沉积土中以革兰氏阳性菌占优势。对海洋细菌的研究已发展到分离菌种、研究群落结构、研究分布规律及生理生态功能等深层次。在一项涉及139份富含原核生物的海洋样本的研究中原核生物种类达到35000种以上，分析显示垂直分层及上层海洋原核生物群落组成主要受温度影响[8]。近海区的细菌密度比远洋大，表层水和水底泥界面处细菌密度比深层水大，底泥中密度比海水中大，泥土中高于沙土。通过宏基因组测序方法对不同深度海洋的物种和宏基因组功能类群进行研究发现不同深度位置上细菌的丰度均超过古菌。
2.3、 海洋真菌
海洋真菌分布广泛，从潮间带到深海、从浅滩到深海沉积物中均有分布。寄主的地理分布范围、海水溶氧量、水温是影响海洋真菌分布和发展的重要环境因素。海洋真菌采取营腐生或寄生方式生活，根据其栖生习性可分为木生真菌、寄生藻体真菌、红树林真菌、海草真菌、寄生动物体真菌等几种生态型。Jones综合考虑多种因素的影响后估计海洋真菌超过10000种，包括专性/兼性海洋真菌、海洋酵母、深海真菌、海洋动植物内生真菌和沉积物真菌等[13]。
2.4、 海洋病毒
海洋是地球上含病毒最多的生态环境，海洋病毒的数量是海洋细胞微生物数量的10倍左右。海洋病毒具有丰富的多样性，人们主要采用宏基因组学方法调查研究海洋病毒多样性。Brum等人使用来自Tara海洋考察项目26个站点的43份样本的定量双链DNA(dsDNA）病毒片段宏基因组和整个病毒群落的形态学数据集评估了上层海洋的病毒群落模式和结构，并通过对病毒蛋白簇、种群以及形态学的多方面分析建立了一个全球海洋dsDNA病毒学数据库以解释海洋病毒群落如何保持高度局部多样性[14]。Roux等人通过分析近期两次国际大洋考察采集的表层和深海病毒样本中的基因组数据，鉴定出15222个病毒种群，包括867个病毒簇[15]。
3 、海洋微生物组的应用
3.1、 发现新种属，开发基因资源
古菌域中三大类群之一的初生古菌门是一类至今仍不可培养的超嗜热古菌，它的分类地位的确定主要是通过对热泉非培养微生物的16SrRNA进行序列分析。通过高通量测序和宏基因组学等方法发现海洋中极低丰度微生物和不可培养微生物，功能宏基因组学还有助于开发具有某种潜能的功能基因资源。Venter等人构建了马尾藻海表层水样微生物的宏基因组文库，通过鸟枪法测序和数据分析发现了1800多种新的海洋微生物及1.21×106种新基因，丰富了人们对海洋微生物物种多样性的认识，为研究海洋代谢潜能提供了大量的信息[16]。Jiao等人从我国东海海底沉积物的宏基因组文库中获得了一种新的编码聚乙酰合成酶的基因[17]。Lee等人[18]构建了韩国西海岸底泥样品的宏基因组文库，筛选到一个编码新型蛋白水解酶的基因，它编码的酶能水解偶氮酪蛋白和纤维蛋白，可用于血栓治疗。
3.2、 从海洋微生物中挖掘新型酶资源
海洋环境复杂，微生物生物化学机能多样，使得从海洋微生物中获取的酶也具有极高的生化及生理机能多样性，加之深海环境还存在高压、贫营养、黑暗等不利生命存在的因素，在深海热液、海底沉积物、海山、深海冷泉等特殊环境中的微生物，其特殊代谢功能也是发掘新型酶资源的重要方向。例如从海洋微生物中获得的能帮助人们规模化制备海洋活性寡糖的海藻多糖降解酶和遗传工程中的热稳定性酶。Chu等人[19]采用功能筛选办法，通过在培养基中添加三丁酸甘油酯和阿拉伯胶作底物，从海洋微生物基因组文库中筛选到了两个新的酯酶，一种能在多种二价离子和高浓度NaCl的溶液中有良好活性，另一个能在30%甲醇、乙醇、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中具有较高的稳定性，有潜在工业应用价值。
3.3、 开发海洋新型活性物质
海洋微生物丰富的天然产物结构类型是新型生物活性物质的重要来源。目前人们从海洋中分离到的化合物主要包括肽类、生物碱类、神经酰胺、内酯类、醌类、酮类、萜烯类及甾体类等，其中的某些活性物质具有抗肿瘤、抗菌能力。Wang等人发现深海沉积物中的真菌Acrostalagmus luteoalbus SCSIO F457产生的两种吲哚二酮哌嗪对四种恶性肿瘤细胞系有抑制作用[20]。Lin等人从1300米深海沉积物样品中分离到一株对卤虾幼虫具有较强毒性的青霉属真菌，从其培养物中分离纯化了一种新的倍半萜醌类化合物青霉素A，该青霉素A对小鼠黑色素瘤（B16）、人黑色素瘤（A375）和人宫颈癌（Hela）细胞株的体外增殖有一定的抑制作用[21]。
3.4、 治理环境污染
Luo等人通过富集培养从东太平洋深海沉积物中分离出一株能以甲醛为唯一碳源和能源的降解菌，18SrRNA序列分析鉴定其为产黄青霉DY-F2[22]。研究人员可以通过构建污染水域的宏基因组文库，筛选有降解靶标物质能力的克隆，将其中的功能基因组成能降解污染物的功能基因簇用于分解环境中的石油烃及其他有毒化合物和重金属。Tremblay等人利用加拿大西部和东部海岸石油降解潜力微观实验中提取的宏基因组和元转录组数据估计了在分散剂存在下石油降解细菌的基因丰度和活性，发现原油中添加分散剂主要有利于原油中两种重要的天然降解菌在夏季和冬季的富集，为分散剂在海洋环境下的石油泄漏治理中的应用提供支持数据[23]。这些研究都为环境污染的治理提供了新思路。
3.5 、研究海洋微生物的生态功能
海洋细胞微生物因其代谢类型多样而在生态系统中扮演多种重要角色，为海洋生态系统的生物地球化学循环提供动力。海洋细菌与真核宿主间也存在复杂的关系，共生或致病等，通过生物活性分子调控形成复杂的化学相互作用体系进行化学交流进而改变宿主的生理和群落组成。海洋病毒可以通过影响海洋细胞微生物进而参与并影响生物地球化学过程。Roux等人的研究鉴定出243个病毒编码的辅助代谢基因，深入分析表明大量的病毒可能直接操控整个海洋表层的氮和硫元素循环，病毒在海洋生态系统的元素循环中可能扮演关键角色[15]。为解析深海微生物群落的代谢结构，Acinas分析了Malaspina Global Expedition全球考察队取自大西洋、印度洋和太平洋的58份深海微生物样本的宏基因组，宏基因组组装发现了11个潜在的新门并揭示混合营养是深海中广泛存在的一种营养策略，增加了人们对地球上最大生态系统的功能多样性、代谢多样性和碳循环的理解[24]。
4、 讨论与展望
全球性的海洋微生物资源考察项目向人们展示了海洋中巨大的新物种和基因资源，2015年间更是有多篇围绕Tara Oceans expedition项目成果的文章在《Science》上集中发表[8,9,25,26,27]，这些研究表明海洋微生物在群落结构、新陈代谢途径、生理生化反应、代谢产物等方面丰富的多样性是有巨大潜能的资源宝库，而微生物组学在研究这个资源宝库方面具有明显的优势。近年来人们在“组学”、高通量及大数据等技术方面及研究思路方面不断创新[28]，助力研究复杂的海洋微生物群体生长及代谢将更好地为人类健康及可持续发展服力。同时，海洋微生物的有效培养手段的不断改进是推动海洋微生物组从描述性研究进一步向功能性研究及应用性研究发展的重要方面。
参考文献
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